MMP-2&MMP-9明胶酶谱法检测试剂盒使用说明介绍

1. 简介：

基质金属蛋白酶 (Matrix metalloproteinase ，MMP) 属于金属蛋白酶家族，该家族由至少 20 个成员组成，并且已知参与细胞外基质蛋白的代谢。它们以无活性的酶原形式分泌，活化后能够降解细胞外基质的胶原蛋白，又称胶原酶。通过影响细胞外基质，胶原酶参与胚胎发育、形态发生、组织重塑等过程，并参与炎症、肿瘤、心血管、神经等许多疾病过程。血浆与组织中的MMP-2、MMP-9参与各种生理与病理过程，其在临床诊断和治疗中的意义日益受到重视。MMP 可通过酶谱法广泛检测。MMP2 & MMP9  Gelatin-Zymography Kit提供了一个简单的酶谱电泳系统，用于检测血液、体液、分泌物、细胞裂解液、细胞培养基等样品中的MMP2,MMP9酶谱及活性。

2. 检测原理：

本试剂盒采用凝胶反相酶谱法(Zymography)检测MMP-2、MMP-9 活性及其无活性前体酶原谱系。Zymography 是一种广为使用的、基于SDS-PAGE 电泳和反相凝胶染色的蛋白酶检测方法，其灵敏度可达1 nM，高于ELISA方法，其基本原理和程序是：制备含有胶原酶底物的SDS-PAGE凝胶，含蛋白酶的样品在此凝胶中进行电泳，电泳时SDS与样本中的MMP可逆性结合，导致MMP氢键和疏水键破坏而不能发挥分解明胶的作用。电泳结束后取出凝胶与酶反应Buffer孵育，MMP恢复活性，凝胶中由于含底物蛋白而被深染，形成深色背景，但在有蛋白酶条带的位置，蛋白酶将降解凝胶中的底物蛋白，因而不被染色而形成透亮区域，从而能同时指示MMP-2、MMP-9 的大小位置(酶谱)及活性。本试剂盒提供MMP-2、MMP-9 特异蛋白底物及酶学反应缓冲液，可检测少至0.1~0.5 μl 血液中的MMP-2、MMP-9 酶谱及活性，检测灵敏度~1nM。试剂盒可进行25-50次标准小胶检测（如果样本MMP含量高，孵育时间短，不用换液可最多50次），如果小胶加样孔为10~15个，则总计可最多检测500~750个样品。

3. 检测目的:

本试剂盒用于检测组织、细胞中MMP-2、MMP-9 酶谱活性及其前体酶原酶谱。

4.  试剂盒组成与储存：

A. 2 × SDS-PAGE non-reducing buffer 1.5 ml, −20 ºC保存；

B. 10 × Substrate G, 50 ml, −20 ºC保存；

C. 10 × Buffer A, 50 ml, 4 ºC保存, 使用时用蒸馏水稀释；

D. 10 × Buffer B, 50 ml, 4 ºC保存, 使用时用蒸馏水稀释；

E. SDS-PAGE 凝胶蛋白质考马斯亮蓝染色液,50ml, 4 ºC保存。

5.检测步骤：

5.1 制备含MMP底物蛋白的SDS-PAGE凝胶：推荐分离胶浓度为8%。按照标准程序制备SDS-PAGE凝胶。将10 × substrate G 融化，并90 ºC 加热5分钟。分别在浓缩胶和分离胶中额外加入10 × substrate G 并使之稀释10倍，混匀后加入过硫酸铵和TEMED，等待凝胶聚合。

5.2 待测样品1:1 稀释于2 × SDS-PAGE non-reducing buffer (用完后可自行配制：4% SDS, 100 mM Tris-Cl  pH6.8, 20% glycerol, 0.02% bromophnol blue)，混合后直接上样。切勿加热变性，并且仅使用不加还原剂的上样缓冲液。可通过预试验确定加样量，使用普通蛋白预染Marker 即可。

阳性对照(可选步骤)：可取人、小鼠、大鼠或兔100μl 全血与100μl 2 × SDS-PAGE nonreducing buffer 等体积混合，取5-15μl 上样。阳性对照也可使用用户熟悉易得的组织细胞样品来制备。 

注：因为全血成分复杂,MMP活性较低，最好是将全血中白蛋白进行分离做阳性对照

5.3 低电流恒流电泳，每一块小胶电流为20mAl。溴酚蓝跑出凝胶前沿时结束电泳。

5.4 洗涤凝胶：取出凝胶，去除浓缩胶，放入容器内。可先用适量蒸馏水冲洗凝胶，然后加入10 ml 1× Buffer A(用蒸馏水稀释)，室温漂洗凝胶36小时，中间18小时换液一次。如MMP活性低，Buffer A 孵育时间可延长至48小时，中间24小时换液一次。

5.5 孵育：倒掉Buffer A。加入10 ml 1× Buffer B(蒸馏水稀释)，室温或37ºC 孵育1~5 小时。阳性对照或者血中的MMP 通常37ºC 孵育1 小时即可显示。如MMP 活性低，应延长孵育时间为10小时或过夜。

5.6 显色：倒掉Buffer B，加入SDS-PAGE凝胶蛋白质考马斯亮蓝染色液（操作步骤见后面所附SDS-PAGE凝胶蛋白质考马斯亮蓝染色液说明书）。凝胶的大部分区域被深染，在有MMP条带的位置不被染色而形成透亮区域。透明区域的位置和范围指示MMP-2、MMP-9 的大小位置(酶谱)及活性。    

MMP透明条带的大小、位置和酶谱的图例。注意因为样品未还原和加热变性，条带位置并不对应推算的蛋白分子量。下图1，正常血浆样品阳性对照可能出现的反相显示的透明条带位置：66kDa(MMP-2)，72kDa(proMMP-2)，87kDa(MMP-9)，92kDa(proMMP-9)，注意血浆中只有很少量的激活状态的66kDa的MMP2，增加上样量在ProMMP2下面隐约可见(最右侧泳道)。

如下图2，不同于正常血浆MMP酶谱，每种组织样品(如牙周膜韧带组织)都具有自己特定的MMP活性酶谱，部分proMMP9(92kDa)可能会结合一个25kDa微球蛋白形成MMP9复合物，条带位置约125-130kDa，其二聚体条带大约在215-225kDa位置(图中并未显现)，多聚体条带位置240kDa，严格说他们都是MMP9复合体，但也有人称其为proMMP-9。注意在这种组织中activeMMP9活性低，但activeMMP2活性高，与血浆MMP活性酶谱形成了鲜明的对比

5.7 条带扫描：将凝胶放在扫描仪上扫描。虽然MMP条带透明，但凝胶背景并非真正全黑。解决办法：可用非透射光扫描，或用软件图像处理程序调整背景显示为灰度显示，并尽量设置为黑色。MMP 条带则为白色，这种背景黑条带白的格式是英文论文中最常见的格式。

6.说明：

1. 10 mM EDTA能够完-全抑制MMP活性。

2. 凝胶干燥：可使用聚丙烯酰胺凝胶干胶装置室温快速干燥凝胶，作为永-久记录保留。

3. 本试剂盒仅供科研实验使用，不得用于食用、临床医疗等其它用途。

4.实验操作中，请穿戴好实验服、防护口罩和一次性实验手套，避免直接接触。严禁入口。