透射电镜全套（包埋+制片+拍照）实验

项目介绍

透射电镜（TEM）通过对组织细胞样本进行树脂包埋切片，60-80nm厚度的超薄切片，经过重金属铅、铀染色后于透射电子显微镜中进行几千至几万倍的放大成像，从而能够清楚的观察到在普通光学显微镜下无法看清的动植物细胞内的超微结构，比如线粒体、内质网、高尔基体、溶酶体、自噬小体、凋亡小体、叶绿体、液泡、细胞内细菌或病毒侵染等结构及病理变化。透射电镜超薄切片除了能够显示细胞内的超微结构之外，还可用于观察病原微生物，如各类细菌真菌等。目前已经广泛应用于细胞生物学、组织学、病毒学、病理学、分子生物学、材料科学等诸多研究领域，是观察和研究物质超微结构的强有力工具。

信帆生物透射电镜平台主要设备包括超薄切片机Leica EM UC7，透射电镜HITACHI HT7700 80kv，透射电镜HITACHI HT 7800 80kv。其中透射电镜HITACHI HT7700、HITACHI HT7800主要技术指标如下：

　　分辨率：1.0nm(加速电压120kV，晶格像)

　　放大倍数：200～200,000 高反差模式

　　4000～600,000 高倍模式

　　50～1,000 低倍模式

　　加速电压：40-120KV

　　实验流程

　　包埋-制片-拍照

　　送样运输要求

　　送样时请下载详细填写附件中的送样单并与样品一起送达信帆生物超微病理实验室。

1、 动物组织样本

① 1-3min内取样，取材前可提前准备装有电镜固定液的培养皿，将小组织块离体取下后立即投入培养皿内，在培养皿的固定液中进行切割成小块，取样组织体积控制在以下尺寸(1mm×1mm×1mm正方体、1mm×1mm×3mm长方体状、1mm×2mm×3mm薄片状)。固定液渗透能力有限，超出此范围后组织会无法固定，后续实验无法完成，务必请重视此过程

② 取材时尽量精确到需要观察的目的部位（如观察肾小球取肾皮质；观察胰岛取胰岛丰富的胰尾；皮肤，肠胃等在固定液中易打卷的组织可将组织粘在滤纸上进行固定）。

③ 取材时一定注意避免镊子挤压等机械损伤，刀片要锋利避免挫伤组织。

④ 组织取下后立即投入电镜固定液内室温避光固定2h，再转移至4℃保存，4℃冰袋运输，在保存和运输过程中固定液切勿冷冻结冰。4°时样本可保存1个月左右

2、 植物组织样本

① 取材要求同动物组织样本。

② 组织投入固定液后需要进行真空抽气让组织沉底，如无条件抽气可用滤纸将组织塞进固定液内，组织不能漂浮在固定液表面。（抽气做出来的效果会好一些）

3、 细胞样本

贴壁细胞：

（看细胞凋亡的，需要把培养液中的细胞也离心收集后固定）

方法一：消化法（实验目的不涉及观察细胞膜相关的内容如：观察紧密连接）

①培养好的细胞（细胞密度不超过70%）弃培养基，加入胰-酶消化。

②胰-酶消化好后（时间不宜过长），加培养基终止消化，吸管轻轻吹打至细胞起浮。吸入离心管，低速离心（不超过3000转），3-5min左右，细胞团要有绿豆大小。

③弃上清，加入电镜固定液（固定液需提前恢复至室温），细胞团吹散重悬。

④室温避光固定30min，再转移至4℃保存，4°℃冰袋运输，在保存和运输过程中固定液切勿冷冻结冰。

方法二：刮取法

①培养好的细胞（细胞密度不超过70%）弃培养基，加入电镜固定液（固定液需提前恢复至室温）。

②常温避光固定5min左右，用细胞刮（或软橡胶盖切得平整小方块）沿一个方向轻轻刮下细胞，切记不要反复刮，避免细胞刮破。

③用巴氏吸管把细胞液吸入离心管内，放入离心机（不超过3000转），低速离心3-5min左右，细胞团要有绿豆大小。

④弃固定液后加新的电镜固定液，细胞团吹散重悬。

⑤室温避光固定30min，再转移至4℃保存，4℃冰袋运输，在保存和运输过程中固定液切勿冷冻结冰。

悬浮细胞：离心收集细胞要肉眼可见细胞沉淀有绿豆大小，弃培养基后加电镜固定液室温避光固定30min，再转移至4℃保存，4℃冰袋运输，在保存和运输过程中固定液切勿冷冻结冰。

4、 细菌样本

长于固体培养基的细菌：连带着培养基一起挑下细菌放于电镜固定液内室温避光固定30min，再转移至4℃保存， 4℃冰袋运输，在保存和运输过程中固定液切勿冷冻结冰。

悬浮细菌孢子等：离心收集细菌要肉眼可见细菌沉淀绿豆大小，弃培养基后加电镜固定液室温避光固定30min，再转移至4℃保存，4℃冰袋运输，在保存和运输过程中固定液切勿冷冻结冰。

5、 病毒

破碎组织细胞，粗离心去除细胞碎片取上清，超速离心分离出病毒（病毒提取的过程需要客户自己完成）。用缓冲液（如PBS）悬浮病毒，体积至少50ul，远距离干冰冻存运输，近距离4℃保存运输，尽快滴片做负染后及时电镜观察拍照。（噬菌体 4度运输）

6、 外泌体囊泡等

客户自己完成外泌体囊泡等的提取收集，用缓冲液（如PBS）或者试剂盒中的保存液悬浮，，体积至少50ul，远距离干冰冻存运输，近距离4℃保存运输，尽快制片做负染后及时电镜观察拍照。（因此类样品极易降解，样品越新鲜越好，最好数小时内完成滴片负染，否则做出的效果很不理想甚至观察不到）

7、 纳米材料等无机材料

直接准备粉剂，或用纯水或无水乙醇悬浮，常温保存运输即可（需要超声的备注）。做负染后电镜观察拍照。